Conceptos Ingeniería Genética 2º Cuatrimestre

Señala el orden de aparición de los plásmidos. El 1 es el primero. 1. 2. 3.

Es el plásmido en el que se utiliza por primera vez polylinker o MCS (multiple cloning site). pUC18. pBR322. ColE1. M13mp18.

Para introducir nuestro vector de fago lambda que lleva nuestro gen en un fago lambda para que infecte una célula de E.coli y pueda transformarse necesitamos. Dos lisógenos de fago lambda con mutaciones complementarias.

En el proceso de "Extractos de encapsidación" en la que se necesitan dos lisógenos de fago lambda con mtaciones complementarias. Proteína D. Proteína E.

En el proceso de "Extractos de encapsidación" en la que se necesitan dos lisógenos de fago lambda con mtaciones complementarias. Lisógeno mutado en D. Lisógeno mutado en E.

Las secuencias "cos" son las secuencias donde cortan las enzimas cos del fago lambda, y determinan el tamaño del fragmento de DNA que se podrá encapsidar en un fago lambda. ¿Cuál es el tamaño de kbp entre dos secuencias cos?. 37-51. 3-5. 20-40.

Señala lo correcto. Los baculovirus tienen un genoma muy grande = 150 kpb. Los baclovirus son virus específicos de plantas. La importancia de usar insectos es que hay líneas celulares inmortales. En los baculovirus se sustituye el gen de la proteína de envuelta celular, que tiene un promotor muy fuerte en los últimos estadíos de infección. La polihedrina es la proteína que forma la matriz proteica, y que se sustituye por el gen de interés.

Señala lo correcto. Utilizamos el baculovirus para conseguir expresar nuestro gen de interés en una célula de insecto. El gen de la polihedrina (matríz de la cápsida del virus) se sustituye por el gen de interés. En una célula de insecto correctamente infectada no observaremos cápsidas, ya que se ha sustituido el gen de la cápsida por el nuestro de interés. Existen dos estrategias para conseguir sustituir el gen de la polihedrina por el gen de interés: 1) Recombinación en las células infectadas 2) Bácmido.

Relaciona en función del proceso que se usa para conseguir sustituir el gen de la polihedrina del baculovirus de insectos por el gen de interés. Recombinación en las células de insecto infectadas. Bácmido.

Relaciona. Vector de expresión. Vector de clonación. Vector lanzadera. Vector de transcripción.

En el sistema binario de Agrobacterium. El plásmido Ti contiene los genes vir y carece de T-DNA. El plásmido Ti contiene el T-DNA y carece de los genes vir. El plásmido que se encuentra desde un inicio en Agrobacterium es el plásmido Ti. El plásmido que introducimos en Agrobacterium contiene el T-DNA modificado (sin genes de hormonas vegetales y con nuestro gen).

En el sistema binario de Agrobacterium. El plásmido Ti es el plásmido vir helper. El plásmido Ti contiene el T-DNA y carece de los genes vir. El plásmido Ti porta un gen de resistencia a antibióticos de E.coli. El plásmido con el T-DNA que introducimos en Agrobacterium tiene secuencias bacterianas además de las que queremos transferir a la planta.

Señala los elementos que encontrarías en el plámsido que contiene el T-DNA en un sistema binario de transformación con Agrobacterium de células vegetales (tanto en el T-DNA como en el resto del plámsido). Origen de replicación en E.coli. Extremo LB y RB. Gen de resistencia de E.coli. Gen de resistencia de Agrobacterium. Gen de resistencia a kanamicina para las células vegetales. Genes vir. Multiple cloning sinte (MCS) o polylinker. Gen de interés con un promotor (por ejemplo CaMV).

¿Cómo detectarías que un gen se está expresando en un tejido determinado si tienes un fragmento de DNA complementario a parte de la región codificante de ese gen, y qué puedes utilizar como sonda?. Mediante un experimento tipo northern. Mediante un experimento tipo western. Mediante un eperimento tipo southern. Mediante PCR utilizando DNA como molde. Mediante transcripción inversa + PCR. Todas las anteriores.

Relaciona. Northern. Southern. Western.

El "paseo cromosómico" y el "salto cromosómico" son. Técnicas de escrutinio de una genoteca. Técnicas para clonar un gen.

Tipos de genotecas. Genotecas de DNA genómico. Genotecas de cDNA. Genotecas de expresión. Genotecas substractivas. Genotecas "phague display". Complementación de mutaciones. Escrutinio con sondas. Paseo cromosómico.

Tipos de métodos para el escrutinio de una genoteca. Escrutinio con anticuerpos. Genotecas de cDNA. Genotecas de expresión. Clonación posicional (paseo y salto cromosómico y amplificación de exones). Genotecas "phague display". Complementación de mutaciones. Escrutinio con sondas.

En el método de escrutinio de una genoteca por "clonación posicional". Paseo cromosómico. Salto cromosómico. Amplificación de exones.

En la amplificación de exones. Nos sirve para identificar una región codificante en la región de DNA que hemos "tanteado" por el paseo cromosómico. Si el fragmento analizado tiene una longitud determinada y contiene un exón, el producto amplificado en la PCR tendrá una longitud menor que la longitud inicial. Los pasos son: 1) intorducir el fragmento a analizar en un vector preparado para tener secuencias flanqueantes que te sirvan después para la amplificación en PCR; 2) Proceso de splicing donde si hay exones en tu muestra se le quitarán los intrones 3) Amplificación en PCR del resultado del splicing, utilizando oligos complementarios a las regiones flanqueantes del vector preparado. Si el fragmento analizado tiene una longitud determinada y no contiene exón sino que es un intrón, el producto obtenido en la PCR serían mayor que el fragmento inicial. Esto se debe a que no se ha producido splicing.

En las genotecas substractivas. Se utilizan para identificar la expresión específica de genes en un momento o tjeido determinado. Se utilizan dos genotecas: driver y tester. La genoteca tester está marcada con biotina. Al final del proceso nos quedamos con los cDNAs que solo se expresan en la condición a analizar.

¿Cómo construir una genoteca de cDNA?. Hay que hacer una digestión total del genoma que quieres meter en la genoteca. En una eletroforesis seleccionas los fragmentos del tamaño adecuado para meter en un vector. El organismo donde se realiza la genoteca puede ser una bacteria o un fago. Se prefieren los fagos, ya que pueden vivir juntos en un mismo tubo sin miedo de que se intercambien información. El problema de una genoteca de gDNA es que hay intrones y exones. A partir del gDNA obtienes el mRNA y lo pasas a cDNA. Para esto usas una columna de afinidad con ligandos (oligodT) que se unen a la cadena poliA y así te quedas solo el mRNA. Luego usas una transcriptasa inversa, una RNAsaH (que elimina el híbrido RNA-DNA) y una DNA pol que te de el cDNA de doble cadena. Por último, insertar el cDNA en un vector adecuado y transformar la bacteria o encapsidarlo en un virus.

La genoteca "phague display". Al fin y al cabo es una genoteca de ligandos. Se basa en la obtención de una proteína de fusión (proteína III del fago + proteína de interés). El fago utilizado es el fago lambda. La proteína pIII es una proteína que se expresa en la cápsida del fago. Se trata de generar fagos con diferentes proteína de interés (tenemos una proteína de interés por cada clon de la genoteca) fusionada con la proteína pIII del fago. Se añaden los diferentes fagos (con diferentes tipos de protéinas fusionadas con la pIII) en un medio con un ligando determinado. Al final de proceso, te quedas con los fagos que expresan proteínas que reconocen el ligando.

En el paseo cromosómico. Es recomendable ir en ambos sentidos si desconoces la posición del gen de interés con respecot a tu marcador. El marcador debe estar íntimamente relacionado con tu gen de interés.

En el método de escrutinio de una genoteca por "escrutinio con sondas". Se fija el DNA de la genoteca en una plaga desnaturalizado preparado para hibidrar. Se utiliza una sonda que puede ser DNA o RNA pero debe estar marcado con S (azufre) 35. La sonda utilizada puede ser homóloga (gran nivel de identidad pues la sonda procede del mismo organismos que el gen de la genoteca) o heteróloga (la sonda pertenece a un organismo diferente que la del gen de la genoteca. La hibridación de la sonda puede ser laxa o restrictiva. La hibridación laxa utiliza utiliza altas temperaturas. La hibridación restrictiva utiliza altas temperatuas. Se pueden utilizar oligonucleótidos degenerados como sondas.

Los "oligonucleótidos degenerados" utilizados en el método de escrutinio basado en sondas. Consiste en generar diferentes oligos de RNA o DNA a partir de la secuencia de la proteína que se quiere detectar. Son degenerados debido a que una misma proteína puede ser codificada por varios oligos, dado que el código genético está degenerado. Hay que usar todos los oligos posibles, siendo imposible reducir el número de oligos a utilizar. Se puede reducir el número de oligos a utilizar analizando la frecuencia del uso de codones en el organismo donde está la genoteca.

La subclonación. Consiste en generar clones de un clon (presunto positivo). Es necesario para hacer más manipulable el inserto del clon "presunto positivo" del proceso de escrutinio. El conjunto de clones formados por subclonación se denomina "minigenoteca".

Señala los métodos para el análisis estructural de un gen (saber si el presunto positivo efectivamente es el gen que estabas buscando, es decir, su secuencia es la que buscábamos). Sublonación (minigenotecas, southern y northern). Mapas de restricción y secuenciación. Análisis transcripcional. Geles de retardo. Aislamiento de factores de transcripción. Método de un-híbrido.

Señala los métodos para el análisis funcional (ver si esa proteína es de unión a DNA o su expresión depende de un proceso y se puede relazionar con él, por ejemplo). Sublonación (minigenotecas, southern y northern). Mapas de restricción y secuenciación. Análisis transcripcional (análisis tipo Northern) con genes reporteros y delecciones seriadas. Geles de retardo. Aislamiento de factores de transcripción. Método de un-híbrido. Análisis transcripcional (análisis tipo Southern) con genes reporteros y delecciones seriadas.

El análisis transcripcional sirve para determinar la función de un gen (análisis funcional). Señala los métodos de análisis transcripcional. Southern Blot. Northern Blot. Genes reporteros. Delecciones seriadas.

La técnica de un-híbrido. Es una técnica de análisis funcional de un gen, específicamente si la proteína que codifica es un factor de transcripción activador o represor de la transcripción. Es una técnica de análisis funcional de un gen, específicamente si la proteína que codifica es un factor de transcripción activador transcripción. Se utiliza un promotor multisecuencia para asegurar la expresión del gen reportero en caso de que se una un FT. Nunca hay falsos negativos (todos los FT se detecttan).

Sobre los vectores lanzadera de levaduras. Hay dos tipos: 1) los plásmidos integrativos 2) los plásmidos replicativos. Los plásmidos replicativos tienen un origen de replicación en levaduras, pero igualmente siempre necesitan integrarse en el genoma de la levadura. El origen de replicación 2micra se encuentra en un plásmido natural de levaduras. Es siempre preferible que no se integre en el genoma de la levadura.

Relaciona sobre los plásmidos integrativos de los vectores lanzadera de levaduras. Plásmido con origen de replicación 2micra. Plásmido con origen de replicación ARS. Plásmido con origen de replicación ARS más centrómero.

Relaciona. Plásmido relajado. Plásmido estricto.

La carga metabólica. Nombre que recibe los efectos negativos que suele acarrear la introducción y expresión de DNA foráneo en el organismo huésped. Puede provocar el gen clonado se expresa a alto nivel y se exporta desde el citoplasma hasta la membrana o el periplasma, puede producir “atascos” en los sitios de exportación, con lo que dificulta la localización correcta de proteínas del huésped. Se puede deber a que el gen clonado se expresa a alto nivel y se exporta desde el citoplasma hasta la membrana o el periplasma, puede producir “atascos” en los sitios de exportación, con lo que dificulta la localización correcta de proteínas del huésped.

¿Por qué es interesante tener una única copia del vector por célula?. Para que se reparta por mitosis equitativamente entre células hijas. Para reducir los efectos nocivos de la carga metabólica. Se puede mantener una población de células transformadas sin necesidad de "presión selectiva con fármacos". Es todavía mejor que se integre en el genoma del organismo, se gana mayor estabilidad y se asegura que la capacidad introducida con la transformación dura durante muchas generaciones sin necesidad de presión selectiva.

¿Qué son los ecotipos?. Organismos muy relacionados entre sí, ya que tienen para un mismo gen secuencias con alguna diferencia. Orgnismos ecologicamente relacionados pero evolutivamente separados. Nombre que reciben los diferentes organismos de una cadena trófica. Son utilizados para encontrar RFLPs.

Señala lo relacionado con lo RFLP. Se usan en estudios Genómicos para mapear el genoma. Son marcadores moleculares. Utilizan técnicas de hibidración de DNA (Northern Blot). Utilizan técnicas de hibridación de DNA (Southern blot).

Un ser humano, ¿cúantos genomas posee?. 2 (3 si contamos el de la mitocondria). 2 (3 si contamos el del cloroplasto). 1 (2 si contamos el de la mitocondria).

Las técnicas genómicas para mapear. Técnica RFLPs. STS (Secuencias que marcan un determinado punto del genoma). Ténica RADP (uso de PCR para encontrar amplicones diferentes). Técnica FISH (hiridación in situ con una sonda que marca los cromosomas). Híbridos por radiación o RHs (permite mapear. ESTs. Paseo cromosómicos.

La ténica FACS. Se utiliza junto a FISH para separar cada cromosoma por su sonda. Utiliza la PCR para encontrar regiones amplificadas diferentes entre ecotipos, de modo que podamos encontrar puntos diferentes en el genoma que puedan ser usados como marcadores moleculares.

Una secuencia de DNA aislada para hibridar con un fragmento de DNA ubicado en un punto concreto del genoma de diferentes especies se denomina. Sonda de DNA. Marcador molecular. Marcador transcripcional.

¿Para qué queremos mutantes nulos?. Queremos un organismo mutante en el gen que queremos recuperar de la genoteca. Si el gen de la genoteca ha sido seleccionado correctamente, el mutante nulo recuperará su función normal. Requiere un proceso de reemplazo génico, es decir, reemplazar la copia buena presente en el genoma por una copia mutada. Para que se integre en el genoma se requiere que no tengan origen de replicación pero sí secuencias recombinogénicas.

Métodos de creación de mutantes nulos. Mutagenesis por extensión de oligonucleótido. Mutagénesis con cassettes. Mutagénesis al azar (doping o PCR con errores). RNA antisentido. RNA interfernecia. Dos-híbrido y tres-híbridos.

El método "doping". Es un método de obtención de mutantes nulos por mutagénsis al azar. Consiste en utilizar diferente proporciones de dNTPs (del nucléotido wild tiype y los otros tres) para conseguir oligonucleótidos que incorporen dNTPs diferenes a la secuencia wild type.

La PCR propensa a errores necesita. Más Mn. Añadir Mn. Más Mg. Modificar la concentración de dNTPs y polimerasa. Añadir dITP (empareja con C, A, T).

La RNasa III es. DICER. RdRp. RISC.

Se encarga de generar más dúplex de RNA. RdRP. RNasa III - Dicer. RISC. siRNA.

Degrada los dúplex de siRNA-mRNA. RdRP. RNasa III - Dicer. RISC. siRNA. Ninguna.

Degrada los dúplex de siRNA. RdRP. RNasa III - Dicer. RISC. siRNA. Ninguna.

Reconoce fragmentos de dsRNA y los fragmenta en fragmentos de 21-23 nt. RdRP. RNasa III - Dicer. RISC. siRNA. Ninguna.

Nombre que reciben los productos de 21-23 nt producidos por DICER-RNasa III. RdRP. RNasa III - Dicer. RISC. siRNA. Ninguna.

El factor de transcripción Gal4p. Es homodimérica. Posee un dominio de unión a DNA (DBD) en el que también se encuentra la región encargada de la dimerización. Posee un dominio de activación de la transcripción (AD). Posee un dominio de unión al activador Gal80p.

Se trata de un promotor sintético. Promotor lac. Promotor tac. Sistema T7. Sistema basado en los promotores del fago lambda, lambdaPL o PR.

Características del promotor lac. Inducible. Fuerte. Posee una transcripción basal, lo que no lo hace útil para proteínas tóxicas.

El promotor tac. Es sintético, pues combina elementos del promotor de la lactosa y del triptófano. La región -35 pertenece al promotor lac. La región -35 pertenece al promotor del triptófano. La posición -10 y la RBS pertenecen al promotor de la lactosa. Se utiliza un fragmento procedente del promotor del triptófano que es más afín por la RNA polimerasa y así aseguramos una transcripción más fuerte. Inducible por lactosa o IPTG. IPTG es degradado. Expresión fuerte.

En el sistema de expresión basado en el fago lambda. La clave de la expresión está en las regiones operadoras izquierda y derecha (lambdaPL y lambdaPR). La proteína cIII es sensible a la temperatura. La proteína cI mutada (cI857) es sensible a la temperatura. La temperatura permisivia (30ºC) es aquella temperatura a la que permites que cI mutada se una a las regiones operadoras e inhiba la transcripción. Con la temperatura no permisiva se impide la transcripción. Tiene la ventaja de que a altas temperturas pueden sintetizarse chaperonas que ayuden al correcto plegamiento de la protéinas de interés, y además pueden formar cuerpos de inclusión al sobreproducirse, facilitando su extracción.

La región operadora es. La región de los operones eucariotas donde se une la RNA polimerasa. La región de los operones procariotas donde se une la RNA polimerasa. Donde se une el inhibidor de la transcripción del operón lacZ.

En el sistema T7. Es inducible con IPTG o lactosa (tanto DE3 como pET). En el genoma de E.coli encontramos el promotor lac asociado al gen de interés. La polimerasa T7 es codificada por el genoma de E.coli, y permitirá que se transcriba el gen de interés presente en el plásmido pET. En el plásmido pET encontramos el gen de interés bajo el control del promotor T7 que es reconocido por la T7 polimerasa y la RNA polimerasa de E.coli. El gen DE3 es la secuencia lisogénica en la que el gen 1 de T7 (codificante de la polimerasa T7) queda bajo el control del promotor lac. No se neceista represor (lacI) ni en E.coli ni en el plásmido pET. El plásmido pLysS contiene el gen de la lisozima T7 bajo el control de su propio promotor (phi 10 promoter). La lisozima T7 es necesaria para eliminar la polimerasa T7 basal e impedir que haya una transcripción basal del gen de interés.

Promotores que NO son inducibles con IPTG o lactosa. Promotor lac. Promotor tac. Sistema T7. Sistema basado en los promotores del fago lambda, lambdaPL o PR.

Promotores que son inducibles con IPTG o lactosa. Promotor lac. Promotor tac. Sistema T7. Sistema basado en los promotores del fago lambda, lambdaPL o PR.

Sobre la desviación en el uso de codones. Se denomina así al fenómeno por las que no todos los codones que codifican un aminoácido se usan con la misma frecuencia. Puede producir problemas en la producción de proteínas en el huésped de la protéina heteróloga. No es un factor limitante en la expresión de una protéina. Un programa para ver la afectación de la desviación en el uso de codones es E.coli Codon Usage Analyzer. Las cepas de E.coli que poseen copoas extras de tRNAS de codones raros se denominas cepas rosetta. Otra alternativa es el plásmido pRARE que aporta los genes de los tRNAs de codones raros. Nunca se modifica la secuencia del gen heterólogo para conseguir que se usen los tRNAs de los codones más habituales de la célula hospedadora.

Relaciona según los vectores que encontramos en Saccharomyces cerevisiae. Vector YIp. Vector Yep.

Ventajas de Pichis pastoris frente a Saccharomyces cerevisiae. Menor nivel de glicosilación. No produce etanol con alta densidad de células. Mayor osmotolerancia. Es más sensible a auxotrofía, por lo que mejoramos el proceso de selección de células transfectadas. El gen de interés puede integrarse en el genoma o replicarse de forma autónoma.

Sobre Pichia pastoris. A diferencia de Saccharomyces, en Pichia pastoris el gen de interés debe siempre integrarse. La integración puede darse por recombinación simple o recombinación doble. En la recombinación sencilla se produce una integración, sin afectar a otros genes. En la recombinación doble se produce el reemplazo del gen de la alcohol oxidasa (AOX1) por el gen de interés bajo el control del promotor AOX1 y su terminador.

Los plásmidos de expresión en levaduras, Saccharomyces cereivisae y Pichia pastoris, se caracterizan por: Tener un origen de replicación que permite su mantenimiento en la célula. Emplear el promotor y el terminador del mismo gen. Llevar promotores inducibles.

Métodos para aumentar la expresión de proteína en células eucariotas. Secuencias de control de la traducción. Expresión de proteínas heterólogas. Sistema Tet Off / Tet On.

Las secuencias de control que se añaden en las células eucariotas para conseguir más expresión de la proteínas, controlan la. Replicación. Transcripción. Traducción.

Secuencia control de la traducción que aporta estabilidad al mRNA. Secuencia K (Kozak). Secuencia S (signaling). Secencia T (tag). Secuencia P (proteolitic). 5' UTR y 3'UTR.

Secuencia control de la traducción que no se traduce. Secuencia K (Kozak). Secuencia S (signaling). Secencia T (tag). Secuencia P (proteolitic). 5' UTR y 3'UTR.

Secuencia control de la traducción que se traducen por histidina. Secuencia K (Kozak). Secuencia S (signaling). Secencia T (tag). Secuencia P (proteolitic). 5' UTR y 3'UTR.

Las secuencias IRES actúan en. cis. trans.

Las secuencias IRES. Se usan en vectores bicistrónicos. Permiten que dos ORFs se transcriban a la vez.

Señala en función del origen de cada elemento del sistema Tet-off/Tet-on. PCMV. TetR-VP16. TRE. TetR.

Relaciona. Microinyección. Transferencia génica mediada por esperma. Clonación tradicional. Clonación Manual.

Relaciona en función del sistema de generación de organismos modificados genéticamente. Uso de recombinasas específicas de sitio. Integración mediada por nucleasas. Plásmidos convencionales. Vectores virales. Trasposones de DNA.

El fosforioato. Es un método para obtener una mayor eficiencia en la técnica de mutagénesis por extensión de oligonucleótido. El fosforioato provoca que haya un azufre (S) en el fosfato alfa de las citosinas. Impide la acción de endonucleasas (por ejemplo PstI).

¿Qué tipo de mapa es anterior cronológicamente (quién va antes)?. Mapa físico. Mapa genómico.

¿Qué tipo de mapa nos muestra la secuencia nucleotídica del DNA que compone el cromosoma?. Mapa físico. Mapa genómico.

¿Qué tipo de mapa nos muestra la posición relativa de los diferentes genes?. Mapa físico. Mapa genómico.

El fago lambda. Para su uso como vector, ¿nos interesa su ciclo lítico o ciclo lisogénico?. Ciclo lítico. Ciclo lisogénico.

La "nick-translation" o desplazamiento de la mella, la lleva a cabo la ADN polimerasa I. Verdadero. Falso. Consiste en sustituir los nucleótidos por análogos marcados. Se utiliza en la ténica FISH. Antes de tratar con DNA pol I se aplican DNasa para generar los nicks (mellas).

El marcaje de los nucleótidos (dNTPs) se realiza. Sobre el fosfato alfa. Sobre el carbono alfa.

El gen lacZ'. Se introduce en plásmidos como pUC. Produce el péptido alfa correspondiente al extremo N-terminal. Complementa con el omega-peptido producido por la cepa de E.coli delta M15.

¿se pueden ligas dos moléculas con extremo romos?. Sí. No.

La enzima Klenow. Pierde la actividad exonucleasa 3'-->5' (reparadora). Pierde la actividad exonucleasa 5'-->3'. Mantiene la actividad exonucleasa 3'-->5' (reparadora). Es una DNA pol III de E.coli. Es una DNA pol I de E.coli.

La enzima Klenow. Elimina extremos 3' sobresaliente en presencia de dNTPs y genera extremos romos. Elimina extremos 3' sobresaliente en ausencia de dNTPs y genera extremos romos. Elimina extremos 3' sobresaliente en presencia o ausencia de dNTPs y genera extremos romos. Tiene actividad polimerasa 3'-->5' (necesita un extremo 3' libre). Tiene actividad polimerasa 5'-->3' (necesita un extremo 3' libre). Rellenado o marcaje de extremos 5' sobresalientes. Marcaje terminal de moléculas de ADN con extremos 3’ sobresalientes en dos fases, exonucleasa 3’ --> 5’ y polimerasa 5’--> 3.

Son un híbrido entre plásmido y fago lambda. Cósmido. Fásmido. Bácmido. YAC. PAC.

¿Qué se necesita para que una secuencia de DNA se empaquete dentro de un fago lambda?. Un DNA que posee dos secuencias cos separadas por 37-51 kb. Un DNA que posee dos secuencias cos separadas por 3-10 kb.

Los cósmidos. Son un híbrido entre plásmido y fago lambda. Poseen dos secuencias cos separadas por 37-51 kb, por lo que pueden empaquetarse in vitro en fagos lambda. La eficiencia de transformación disminuye al usar fagos lambda. Permite aumentar el tamaño del inserto hasta 46 kb. No pueden empaquetarse in vitro.

Sobre los fásmidos. Son plásmidos que contiene el origen de replicación del fago P1. La presencia del "ori f1" permite la producción de ssDNA, que se empaquetará en partículas de M13, que luego se extraen. Se necesita la presencia de un fago helper (fago M13 wild type) para producir el ssDNA. En ausencia del fago helper, se pueden recuperar la construcción completa con el dsDNA. El fásmido lambdaZAP puede replicarse de forma normal como un vector del fago lambda, pero en el momento en que añadas un fago helper, se extraera el ssDNA correspondiente a tu gen de interés.

Métodos de escrutinio de una genoteca. Escrutinio con sondas (DNA, RNA marcado heteróloga u homóloga, u oligonucleótido degenerados). Complementación de mutaciones. Escrutinio con anticuerpos. Clonación posicional (paseo, salto y amplificación de exones).

Sobre los métodos de escrutinio de una genoteca. Complementación de mutaciones. Escrutinio con sondas. Escrutinio con anticuerpos. CLonación posicional.

El fago lambda es un fago de DNA de cadena sencilla. Verdadero. Falso.

El fago M13 es un fago de DNA de cadena sencilla, y además de polaridad positiva (+). Verdadero. Falso.

El fago M13. Es un fado de DNA de cadena sencilla (ssDNA) y polaridad negativa. Usa la DNA pol bacteriana para formar dsDNA en el interior celular y no ser degradado. La forma dsDNA se denomina Forma Replicativa (FR). Infecta a E.coli uniéndose a sus pili. Se replica mediante el círculo rodante. No se puede utilizar para la secuenciación. Lisa las células.

El fago P1. Presenta permutación circular. Se utiliza en los PACs. Permite clonar y expresar grandes cantidades de ADN (hasta 80-90 Kb). Se integran.

La cepa E.coli DH5 alfa. Es una cepa de E.coli con 3 mutaciones, entre las que se encuentra la mutación lacZM15. Para tener actividad beta-galactosidasa necesita la alfa-complementación.

¿Qué tipo de vector posee en su construcción sitios cos y loxP , pero no se empaqueta en una cápsula vírica?. YAC. BAC. HAC. Cósmido. Fásmido.

Los BACs. Poseen un origen de replicación denominado "oriS". Permite que haya una copia por célula. Posee sitio cos y loxP que se usan para la introducción del inserto. Puede introducir 200 kpb.

Los YACs. Cuando se inserta el gen de interés, esperamos ver las levaduras de color blanco. Permiten introducir 100-500 kpb. Se utilizan marcadores de auxotrofía para levaduras, y un gen de resistencia bacteriano. Presenta una secuencia ARS para replicación en levaduras, y un origen de replicación bacteriano. Tienen el problema de ser muy inestables, frágiles y perderse en mitosis.

En los vectores de plantas. Los geminivirus. Son virus de plantas y protozoos. Su interés radica en que están especializados en distribuir su genoma por toda la planta. Infectan un rango estrecho de especies. Están compuestos por dos moléculas circulares de DNA bicatenario. Están compuestos por dos moléculas lineales de DNA bicatenario.

En los geminivirus. Se componen de dos moléculas de DNA monocatenario (DNA-A y DNA-B) que pasan a ser bicatenarios en el interior de la célula vegetal. Ambos (DNA-A y DNA-B) se replican en el interior celular vegetal. El DNA-B es necesario para la infección. Las proteínas de capsidación se encuentran en DNA-A y no son necesarias para la infección. Las proteínas de capsidación se encuentran en DNA-B y no son necesarias para la infección. El DNA-A es el utilizado para introducir nuestro gen. Luego va a un sistema binario en Agorbacterium (que posee el plásmido Ti helper). La planta posee copias del DNA-B para permitir la infección del DNA-A.

Vectores utilizados en animales. Baculovirus (células de insecto). SV40 (virus de mono). HACs. Virus vaccinia (gripe). Retrovirus.

Relaciona en función de los vectores utilizados en animales. SV40. Virus vaccinia. Baculovirus. Retrovirus. HAC.

En los sistemas de etiquetado. El níquel se encarga de capturar la cadena de polihistidina presente en la proteína. El imidazol libera la proteína unida al níquel. La etiqueta sólo puede ir en el extremo N.terminal.

Relaciona. Plásmido. Lambda inserción. Lambda reemplazamiento. M13. Fásmido. Cósmido. PAC. BAC. YAC. HAC.

Señala la correcta. La transformación con liposomas sólo es útil si no hay pared. La transformación con electroporación funciona incluso con pared. Con la electroporación podemos meter mayor tamaño de DNA y se mantiene la viabilidad. La microinyección consiste en insertar el DNA recombinante en los pronúcleos de ovocitos. Los organismos en los que no funcionan la mayoría de los métodos de transformación se denominan recalcitrantes.

Señala lo correcto. Los plásmidos son estructuras de doble cadena que se replican de forma independiente al DNA cromosómico. En el plásmido ColE1 el gen cea codifica para una toxina (colicina), mientras que el gen imm aporta la resistencia. En el plásmido ColE1, su replicación depende de dos RNA (I y II) y del producto del gen rop. En el plásmido ColE1, en la época solo se conocía un sitio de restricción que no afectaba a los genes de ressitencia, de tal manera que no se podían distinguir las colonias transformadas de las no transformadas.

Señala lo correcto. En el plásmido pBR322 tenemos dos genes de resistencia con un sitio de restricción cada uno. La detección de la transformación requiere un doble escrutinio:primero con el antibiótico en el que no se ha insertado para eliminar colonias no transformadas, y un segundo con el antibiótico donde se ha insertado donde las colonias que han sido transformadas y portan el inserto desaparecerán. El plásmido pUC permite un único paso de escrutinio. Porta un gen de resistencia a ampicilia, el gen lacZ' correspondiente al fragmento N-terminal de la beta-galactosidasa. En lacZ' se encuentra el MCS donde se insertará el gen. Un oriC. El sistema cre recombinasa permite intercambiar fragmentos de DNA entre plásmidos. El plásmido donador tiene 2 sitios loxP y el aceptor sólo un sitio loxP. En el PAC la correcta ligación solo ocurre entre el inserto del tamaño adecuado, el brazo largo y un brazo corto. En el PAC tenemos dos origees de replicación del fago P1: P1 plasmid replicon y P1 lytic replicon. El segundo se activa con IPTG y permite obtener un gran nº de compias.

Señala lo correcto. Los BACs tiene un oriS que les permite mantene una única copia. En los animales no existen plásmidos de forma natural, por eso se han utilizado virus. En los vectores de expresión se suele introducir intrones porque aportan estabilidad al mRNA.

En los métodos de selección de células de mamífero encontramos. Sustratos: Hipoxantina, Timidina Inhibidor: Aminopterina. La aminopterina bloquea las rutas normales de sintesis de inosina fosfato y timidina fosfato. La DFHR (dihidrofolato reductasa) es inhibida por el metotrexato. Pero nosotros metemos en el plásmido un mayor nº de copias o la modificamos para que sea resistente.